免费论文：蛋白酶消化细胞表面蛋白恢复模型

目的 跨膜蛋白是通过膜泡运输方式运输至细胞表面的，细胞骨架体系为蛋白质的定向运输提供轨道和动力，当细胞骨架出现紊乱，很可能导致细胞内蛋白运输出现障碍，从而影响其在细胞膜表面的定位。跨膜蛋白属于糖蛋白，当糖基化修饰受到抑制不能形成有功能的构象时，也可能影响膜泡的组装，阻碍细胞内蛋白质的运输。本实验对K562细胞表面的两中标志蛋白血型糖蛋白A（GPA）和转铁蛋白受体（CD71）进行切除后再培养，建立膜蛋白的消化恢复模型，在此基础上观察细胞骨架抑制剂和糖基化修饰抑制剂对GPA和CD71恢复的影响，来探索跨膜蛋白转运的分子机制。 方法 细胞消化实验，通过台盼蓝染色细胞计数和FITC-荧光标记抗体染色流式细胞仪检测来确认将GPA和CD71位于胞外部分的蛋白切除的链霉菌蛋白酶浓度和消化时间；细胞恢复实验，细胞消化后再培养，不同的时间点取样，流式细胞仪检测GPA和CD71恢复情况，建立恢复模型；细胞毒性实验，细胞在24孔板中培养12h后加入不同浓度梯度的抑制剂，再培养24h细胞计数，观察抑制剂剂量与细胞存活率的数量关系；加入抑制剂后细胞恢复实验，细胞消化后再培养时加入一定浓度的抑制剂，以不加抑制剂的同步培养为参照，流式细胞仪检测GPA和CD71的恢复情况。结果 浓度为1mg/ml的链霉菌蛋白酶（streptomyces griseus protease） 溶液，37℃水浴消化细胞30 min 后，可将K562细胞膜蛋白GPA和CD71位于胞外的蛋白切除；重新培养培养24小时GPA完全恢复，12小时CD71完全恢复；当培养液中含0.025µM的秋水仙素（Colchicine），1.17nM的紫杉醇（Paclitaxel），1.97nM的细胞松弛素D（Cytochalasin D），1.27nM的鬼笔环肽（Phalloidin），1µg/ml的衣霉素（Tunicamycin），25µg/ml的苄基-2-乙酰胺-2-脱氧-D-吡喃半乳糖苷(Benzyl-2-acetamindo-2-deoxy-2-D-galactopyranoside)时，显著降低K562细胞的存活率；秋水仙素对CD71有促进恢复的效果，紫杉醇、衣霉素对CD71的恢复有抑制效果，衣霉素对GPA的恢复有抑制效果。

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