免费论文摘要：丹参乙烯相应因子基因（SmERF1）的克隆及功效接洽

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属有年生草本植被，以其根及根茎入药，具备活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的工效。丹参含有多种活性因素，重要有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类，在临床上被普遍运用于心血管病症及多种炎症的调节。动作我国常用大量药材之一，丹参需要量日益延长。跟着新颖国药材典型化培植本领的兴盛，我国渐渐产生了多个丹参培植产区，但连年来病虫害已重要感化了丹参原药材的品德和产量。运用底栖生物本领本领来深度发掘丹参的抗洪基因齐头并进一步接洽植被抗洪体制，是挑选和培养崇高丹参种质的灵验战略。基于此，本课题安身于已有的接洽功效，贯串丹参转录组高通量数据库，从转录程度克隆获得1条乙烯相应因子基因（ethylene response factor, ERF），贯串基因的底栖生物消息学领会截止和表白形式领会情景，运用RNA干预本领（RNAi）和外源基因变化本领对该基因的功效举行发端接洽，为丹参的抗洪机理接洽供给了确定的参考材料。重要接洽实质及截止如次： 1. 运用RT-PCR和PCR本领辨别以丹参cDNA和gDNA为沙盘克隆获得1条AP2转录因子家属基因，该基因无内含子，其盛开观赏框为621 bp，源代码206个氨基酸酸。底栖生物消息学领会表露：其卵白分子量为15.003 kDa，等电点为5.887，为亲水性卵白。 2. BlastP序列比对截止表露该基因与拟南芥、百脉根、羊桃和毛果杨等植被的ERF类转录因子一致度较高。该基因具备典范的AP2/ERF贯串域，AP2/ERF构造域中的YRG元件地区，含有3个β折叠，个中第2个β折叠中的第14和19位的两个氨基酸酸残基辨别为丙氨酸和天冬氨酸。按照该卵白的氨基酸酸序列特性，将其归类于AP2超家属中EREBP亚族的分支——ERF类转录因子，并将该基因定名为丹参SmERF1。 3. 运用及时荧光定量PCR领会SmERF1基因的表白形式，截止表露：SmERF1基因在丹参根中的表白量明显高于茎、叶和花中；立枯丝核菌可明显开辟该基因的表白；同声还创造该基因能相应植被荷尔蒙MeJA、ABA和ET的开辟。 4. 以pKannibal为中央载体，pART27为表白载体，经过PCR及控制性内切酶酶切的本领建立SmERF1基因的干预载体，运用根癌农杆菌介导的叶盘法将重组表白载体转入丹参中。运用及时荧光定量PCR本领检验和测定 SmERF1基因在丹参转基因株系中的表白丰度，挑选出干预功效鲜明的11号、18号和22号3个丹参转基因干预株系。 5. 采用立枯丝核菌，对SmERF1干预株系和比较株系举行熏染，查看各株系内与抗洪关系的酶类和病理产品的变革情景。截止表露，在蒙受病原微底栖生物立枯丝核菌熏染后，SmERF1干预株系植株表露动身病早、妨害重等局面，体内的丙二醛（MDA）含量明显高于野生型株系（CK）和机载株系（PDK）株系，还原形谷胱甘肽（GSH）和脯氨酸（Pro）含量明显低于CK和PDK株系；检验和测定与抗洪关系的酶类活性创造，干预株系中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化学物理歧化酶（SOD）活性均明显低于CK和PDK株系，而过氧化学物理酶（POD）无明显性分别。 6. 运用及时荧光定量PCR本领检验和测定干预、CK和PDK株系中抗洪关系基因以及次生新陈代谢道路上关健酶基因的表白变革。截止表露，与比较比拟，干预株系抗洪关系基因中，病程关系卵白基因PR-10、SmSTH-2和丹参提防素基因PDF 2.1的表白量均明显下调；在丹参萜类道路上采用检验和测定的关健酶基因中，MVA道路上的HMGR1与HMGR2基因表白量均明显下调，而HMGR3基因表白量明显上调；DXP/MEP道路中，DXS1和DXS2基因表白量均明显上调，DXR基因表白量无明显性分别；萜类卑劣道路中的关健酶基因GPPS、GGPPS1和GGPPS3表露明显性下调，GGPPS2表白量无明显性变革。 7. 运用HPLC本领检验和测定转基因丹参中脂溶性因素的新陈代谢积聚。截止创造，转基因株系中，隐丹参酮与丹参酮ⅡA含量与CK和PDK株系比拟均明显低沉；二氢丹参酮含量与比较比拟无明显性变革

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