论文摘要：赤拟谷盗p53类似基因的克隆及mRNA表达研究

赤拟谷盗Tribolium castaneum (Herbst) 不仅是在世界范围内广泛分布且具有重要经济意义的储藏物害虫，同时也是一个非常重要的模式物种，它隶属于节肢动物门(Arthrooda)，昆虫纲(Insecta)，鞘翅目(Coleoptera)，拟步甲科(Tenebrionidae)，拟谷盗属 (Tribolium)。目前世界上公认的防治储粮害虫性能最优良的熏蒸剂之一是磷化氢，但长久以来，由于单一的使用磷化氢熏蒸，加之施用方法不当，导致赤拟谷盗对磷化氢产生了抗药性。近年来，针对赤拟谷盗抗药性的相关研究，特别是分离磷化氢抗性的相关基因及探究其功能成为一大研究热点。
到目前为止，p53基因是与人类肿瘤相关程度最高的基因。正常情况下，细胞内p53蛋白的表达水平很低，当p53基因的表达量升高时，说明p53基因被激活。p53基因的激活是需要一定条件的，当细胞受到特定细胞因子的刺激或发生DNA损伤、缺氧、代谢抗性转变时都会激活p53基因，p53基因激活后将参与DNA损伤的修复、细胞周期的调控、诱导细胞凋亡等过程。近期多项研究表明，p53基因作为细胞代谢过程中重要的中介因子，不仅与肿瘤抑制有关，其对于线粒体呼吸也具有重要的调节作用。p53能够调节有氧呼吸与糖酵解的有效平衡，与呼吸过程中活性氧的产生、氧化应激、细胞死亡等过程都具有显著地相关性。
本实验室在前期的研究中已经从赤拟谷盗全基因组和EST文库中通过构建赤拟谷盗部分基因组文库并采用生物信息学方法筛选出28对微卫星 (STR) 多态性引物，结果发现，位于赤拟谷盗3号染色体的STR多态性位点DT802192 (EST来源)在抗性品系中存在着明显的多态性缺失现象，提示该分子标记与磷化氢抗性基因相关，深入分析又发现，p53类似基因存在于此标记上游，因此研究p53类似基因的mRNA表达水平，可为赤拟谷盗磷化氢抗性的产生机制提供理论基础。
本研究拟以赤拟谷盗为研究对象，采用RT-PCR技术从赤拟谷盗体内克隆获得p53类似基因的编码区全长序列；并利用生物信息学方法分析其核苷酸序列和蛋白质序列；采用荧光实时定量RT-PCR (qRT-PCR) 技术检测了不同品系赤拟谷盗各发育时期在磷化氢胁迫下p53类似基因的mRNA表达量。研究结果如下：
    1. 赤拟谷盗p53类似基因编码区全长为825 bp，共编码274个氨基酸。GenBank 登录号为XM_961543.2，该基因编码的蛋白质分子量为30894.0 Da，理论等电点pI=5.55。同源分析表明该蛋白与其它昆虫的相似度不高，运用生物信息学方法分析，该蛋白没有信号肽出现，因此属于亲水性的非分泌型蛋白；该蛋白不存在跨膜区域，因此p53类似蛋白为非跨膜蛋白；功能基序发现该蛋白具有多个功能位点；该蛋白的二级结构是mix型；其三级结构在数据库中未找到与之匹配的模型。
    2. 不同品系赤拟谷盗的p53类似蛋白比对结果表明，共有6个位点产生不同，分别位于比对后的21、102、108、116、229、251位点。通过motif scan在线预测各蛋白序列的功能基序，最终发现同NCBI已提交的序列相比，测序的其中一个敏感品系单克隆多一个磷酸激酶C磷酸化位点 (Protein kinase C phosphorylation site)，多出的位点位于其序列的252 ~ 254位点 (SRR)；测序的其中一个抗性品系样品单克隆少一个磷酸激酶C磷酸化位点 (SCK)。
3.本研究使用 qRT-PCR技术评价8个内参基因——β-actin、GAPDH、α-Tubulin、SYN1、SYN6、RPS3、RPS18、RPL13a在磷化氢诱导后的不同品系赤拟谷盗中的表达水平，采用相对定量方法并分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。其中经geNorm软件分析的8个内参基因的稳定性由高到低排列顺序为RPS18 = RPL13a (0.007) > SYN6 (0.015) > RPS3 (0.038) > β-actin (0.044) > α-Tubulin (0.105) > SYN1 (0.154) > GAPDH (0.205)，且内参基因配对差异值V2/3值为0.006，从而确定内参基因的最适数目为2个，分别为RPS18和RPL13a。NormFinder与geNorm相似，其运行结果以稳定值的大小排序，经NormFinder分析的各内参基因的稳定性由高到低的排列顺序为RPS18 (0.002) > RPL13a (0.016) > β-actin (0.042) > RPS3 (0.044) > SYN6 (0.055) > α-Tubulin (0.066) > SYN1(0.077) > GAPDH (0.126)，由此得出RPS18的稳定性最高，最终由该程序判定的最佳组合是RPS18和RPL13a。因此，geNorm和NormFinder两款软件的分析结果一致，最终确定相对适合的内参基因有两个： RPS18和 RPL13a。
4. 采用建立的qRT-PCR方法检测了p53类似基因分别在卵、4龄幼虫、蛹、成虫四个发育时期在不同磷化氢胁迫条件下的相对表达水平，检测结果表明：a. p53类似基因在不同品系赤拟谷盗卵期中均有表达，但响应程度不同；其次，敏感品系和抗性品系分别经磷化氢诱导后，表达量均发生变化。在未熏蒸条件下，敏感品系和抗性品系的p53类似基因表达在统计学上无显著意义即 (p>0.05)；敏感品系在磷化氢诱导下，表达量显著上调；抗性品系在磷化氢诱导下，表达量呈现逐渐上升的趋势。b. p53类似基因在不同品系赤拟谷盗幼虫期中均有表达，但响应程度不同；其次，敏感品系和抗性品系分别经磷化氢诱导后，表达量均发生变化。在未熏蒸条件下，敏感品系和抗性品系的p53类似基因表达在统计学上无显著意义即 (p>0.05)；敏感品系在磷化氢诱导下，表达量显著上调；抗性品系在磷化氢诱导下，表达量在20 h时急剧下降，随后呈现逐渐上升的趋势。c. p53类似基因在不同品系赤拟谷盗蛹期中均有表达，但响应程度不同；其次，敏感品系和抗性品系分别经磷化氢诱导后，表达量变化不明显。在未熏蒸条件下，敏感品系和抗性品系的p53类似基因表达在统计学上无显著意义即 (p>0.05)；敏感品系在磷化氢诱导下，表达量无明显变化；抗性品系在磷化氢诱导下，表达量亦无明显变化。d. p53类似基因在不同品系赤拟谷盗成虫期中均有表达，但响应程度不同；其次，敏感品系和抗性品系分别经磷化氢诱导后，表达量均发生变化。在未熏蒸条件下，敏感品系和抗性品系的p53类似基因表达在统计学上有极显著意义即 (p<0.01)；敏感品系在磷化氢诱导下，表达量发生明显上调；抗性品系在磷化氢诱导下，表达量在20h和60h时均无明显变化，在100 h时表达量明显下调。结合上述内容，本实验运用相对荧光实时定量技术对不同品系赤拟谷盗各发育阶段在磷化氢的胁迫下p53类似基因表达量研究，可得出p53类似基因可能参与赤拟谷盗的磷化氢抗性机制：磷化氢胁迫下p53类似基因的下调表达可能与磷化氢的抗性产生相关，而上调表达可能与赤拟谷盗的致死相关。

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